4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств этилфенацина
в воде методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.2294-07

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 10 октября 2007 г.

4. Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Содержание

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко

10 октября 2007 г.

Дата введения: 25 декабря 2007 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств этилфенацина
в воде методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрации этилфенацина в диапазоне 0,0002 - 0,004 мг/дм³.

2-(α-фенил-α-(4-этилфенил)-ацетил)-индан-1,3-дион (IUPAC)

С₂Н₅

С₂₅Н₂₀О₃

Мол. масса 368,12

Твердое вещество светло-желтого цвета с цветочным запахом. Температура плавления 180 - 181°С. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей (ацетоне, этаноле, диэтиловом эфире и др.). Практически не растворим в воде - 1,29·10^-3 мг/дм³.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 1 мг/кг.

Область применения

Этилфенацин - ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью, рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) на зимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковые насаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона. Применяется в виде приманки.

ОДУ этилфенацина в воде водоемов - 0,0008 мг/дм³.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n=20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта на патроне для твердофазной экстракции Sep-Pak Silica.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

	Номер в Государственном реестре средств измерений
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы реестре средств измерений Waters, США)	15311-02
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2	ГОСТ 1770
Меры массы	ГОСТ 7328
Пипетки градуированные 2 класса точности, вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3	ГОСТ 29227
Пробирки градуированные, вместимостью 5 или 10 см3	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2 класса точности, вместимостью 10, 50, 100 и 1000 см3	ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Этилфенацин, аналитический стандарт с содержанием основного вещества (сумма изомеров) 97,9%, в том числе пара-изомер - 61,48%, орто-изомер - 36,42% (ЗАО «Щелково Агрохим»)
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ 6-09-4326-76
Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМпО4	ГОСТ 6709
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-33-75
Натрий серно-кислый безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Кислота орто-фосфорная, хч, 85%	ГОСТ 6552
Метилен хлористый (дихлорметан), хч	ГОСТ 12794
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) эталонный	ГОСТ 4166

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные	ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные вместимостью 1000 см3	ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм	ГОСТ 25336
Груша резиновая
Колбы плоскодонные вместимостью 200-250 см3	ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 10, 100 и 250 см3	ГОСТ 9737
Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм
Насос водоструйный	ГОСТ 10696
Патроны для твердофазной экстракции типа Sep-Pak Sillica Cartridges (масса сорбента 690 г)
Пробирки центрифужные	ГОСТ 25336
Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария	ТУ 25-11-917-74
Стаканы химические, вместимостью 50 и 100 см3	ГОСТ 25336
Стекловата
Стеклянные палочки
Установка для перегонки растворителей
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry® С18, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50-100 мм3
Шприц медицинский с разъемом Льюера	ГОСТ 22090

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведения вещества на них, отбор проб.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5% водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 870 см³ ацетонитрила, 130 см³ бидистиллированной или деионизованной воды и 1 см³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.4.1. Исходный раствор этилфенацина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,01 г этилфенацина, добавляют 50-70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1-5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор № 1 этилфенацина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³)

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора этилфенацина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.4.3. Рабочие растворы № 2-5 этилфенацина для градуировки (концентрация 0,05-1,0 мкг/см³)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 10,0 см³ градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2-5 с концентрацией этилфенацина 0,05; 0,1; 0,25 и 1,0 мкг/см³ соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость суммы площадей 2 пиков орто- и параизомеров этилфенацина (мкВ·с) от концентрации вещества в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки №№ 2-5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 7.5.1. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков изомеров действующего вещества, рассчитывают сумму площадей орто- и параизомеров этилфенацина.

Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2 растворов для градуировки различной концентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.6. Приготовление 1% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50-70 см³ этилацетата, вносят 2 см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep-Pak Silica для очистки экстракта

Патрон Sep-Pak Silica устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 см³, используемый в качестве емкости для элюента.

Концентрирующий патрон промывают последовательно 5 см³ этилацетата, затем 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Примечание: В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1-2 капли в сек.

7.8. Проверка хроматографического поведения этилфенацина на концентрирующем патроне Sep-Pak Silica

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочного раствора № 1 этилфенацина (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток растворяют в 2 см³ этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Этилфенацин элюируют с патрона 40 см³ 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая 5 порций элюата по 5 см³ каждая непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в каждой колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание этилфенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие этилфенацин, объединяют и вновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения этилфенацина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 10 недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18°С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образец анализируемой воды объемом 500 см³ помещают в делительную воронку, вместимостью 1000 см³, добавляют 75 см³ хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу, вместимостью 250 см³, фильтруя его через 2 см слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями этилацетата по 50 см³. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 см³ этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Silica, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Этилфенацин элюируют с патрона 35 см³ 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание этилфенацина по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США).

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry® С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-орто-фосфорная кислота (87:13:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Рабочая длина волны: 312 нм.

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Ориентировочное время выхода этилфенацина:

- орто-изомер: 8,18-8,24 мин

- пара-изомер: 9,25-9,30 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1-20 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор этилфенацина с концентрацией 1 мкг/см³, разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание изопропилфенацина в пробе рассчитывают по формуле:

где Х- содержание этилфенацина в пробе, мг/дм³;

А - концентрация этилфенацина, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков орто- и параизомеров, мкг/см³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

V - объем анализируемого образца воды, см³.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

,                                                                                 

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r=2,8σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/дм³ при вероятности Р=0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³;

 - граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

, где

 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,0002 мг/дм³»*

_________________________

* - 0,0002 мг/дм³ - предел обнаружения

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 - ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок. Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

,где

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/дм³, при этом:

, где

 - граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

, где

 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, где

 - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

,                                                                                                                     (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

, где                                                                                           (3)

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.